第四军医大学神经科学研究所脊髓损伤研究中心孟晓梅王春婷游思维刘惠玲杨浩焦西英刘飞史明鞠躬

摘要

目的：观察纤维蛋白胶(FG)包裹嗅神经鞘细胞(OECs)植于成年大鼠脊髓全横断断端间隙内对损伤轴突再生的促进作用。　

方法：成年雄性SD大鼠16只,行脊髓T11节段全横断术。FG-OECs组于间隙内移植FG包裹的OECs,FG对照组移植等量的FG,OECs对照组移植等量DF12-OECs悬液,单纯全切对照组未做任何移植,每组动物4只。术后2周处死动物,脊髓损伤区冰冻水平切片,荧光显微镜下观察OECs的存活及迁移,并行抗神经丝(NF)和生长相关蛋白-43(GAP-43)抗体免疫组织化学染色。　

结果：OECs及单纯全切对照组脊髓两断端连接较差,而FG对照组及FG-OECs组两断端连接良好。FG、OECs及单纯全切对照组损伤区可见少量NF及GAP-43免疫反应纤维;FG-OECs组间隙内OECs大量存活,并迁移至两侧脊髓实质内,大量NF及GAP-43免疫反应纤维通过间隙。　

结论：FG包裹的OECs可在成年大鼠脊髓全横断断端间隙内存活并迁移至脊髓实质内,促进损伤轴突的再生。

成年哺乳动物中枢神经损伤后缺乏再生的能力,但同属中枢神经系统的嗅球却具有终身支持嗅神经再生进入嗅球的能力,其原因就在于嗅觉系统中独特的嗅神经鞘细胞(OECs)。OECs是位于嗅上皮、嗅神经和嗅球外层的一种胶质细胞,同时具有星型胶质细胞和施万细胞的特性,能够分泌神经营养因子和细胞粘连分子,其形成的细胞索支架,能引导再生轴突进入嗅球,到达靶细胞[1,2]。移植OECs修复成年哺乳动物中枢神经损伤,已被证明具有光明的临床应用前景[3]。

Ramón-Cueto将OECs植入成年大鼠脊髓全横断断端实质中,使损伤轴突跨越断端再生,并取得了后肢运动功能的部分恢复[4]。由于将微玻管插入脊髓实质内移植OECs对脊髓造成额外的损伤,Ramón-Cueto本人曾尝试将OECs悬液植入断端间隙,但发现OECs在间隙内与脊髓断面接触不佳,OECs难以迁移进入脊髓实质内,不能建立起桥梁,脊髓两断端的良好连接也是影响进一步功能恢复的重要因素[5,6]。纤维蛋白胶(FG)是一种组织相容性良好的生物胶,有学者用来粘合固定脊髓横断面与断端间隙中移植的周围神经[7]。因此,我们尝试以FG包裹OECs并植于断端间隙内,观察其存活及向脊髓实质内的迁移、对损伤轴突再生的促进作用,以及间隙内应用FG是否有利于脊髓两断端的连接。

材料和方法

1.OECs的培养、纯化、鉴定与标记

取同种异体成年雄性SD大鼠嗅球神经纤维及颗粒层,以含10%胎牛血清的DF12(Gibco)培养7～10d,为去除其中混杂的成纤维细胞,差速贴壁2次,抗-P75及抗S-免疫细胞化学染色,阳性OECs纯度在90%以上。将核荧光染料Hoechst(10mgL,Sigma)加入培养液DF12中标记OECs,37℃暗箱中孵育10min。用DF12彻底洗去染液,0.%胰蛋白酶消化细胞,洗去胰蛋白酶,以DF12或FG将OECs制成μl细胞悬液。

2.动物及手术方法

成年雄性SD大鼠16只,体重～g,由第四军医大学动物实验研究中心提供。1%戊巴比妥钠(35mgkg体重)腹腔注射麻醉动物,手术显微镜下背侧入路打开椎板,暴露脊髓T11节段。剪开硬脊膜,以锋利刀片尖切割脊髓,为除外残留纤维的可能,抬起断端确定其完全离断[8]。动物随机分为4组,每组4只。FG-OECs组以微玻管于多点分次将总量为2μl的FG-OECs悬液注入间隙内;FG对照组间隙内同法移植等量FG;OECs对照组间隙内同法移植等量DF12-OECs悬液;单纯全切对照组断端不做处理。分层缝合伤口。FG、OECs的准备及手术过程均严格无菌。术中动物注意保温,术后人工辅助排尿、抗感染及其他截瘫后护理。

3.免疫组织化学染色

术后2周过量麻醉处死动物,4%多聚甲醛经右心室常规灌注固定。脊髓损伤节段取材,置20%蔗糖中(4℃)过夜,恒冷箱连续水平切片(厚14μm),分3套相邻切片留取。1套以荧光封片剂(Sigma)封片,紫外激发光下观察OECs的存活及迁移。另2套切片分别行抗神经丝(NF,1∶,抗体稀释液中含1%BSA,Sigma)和抗生长相关蛋白-43(GAP-43,1∶0,抗体稀释液中含1%BSA,由哈佛大学Benowitz教授提供)。常规ABC法免疫组织化学染色,葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍铵显色,光镜下观察NF及GAP-43免疫反应纤维。

结果

1.断端连接的观察

取材时见FG对照组及FG-OECs组各例脊髓两断端连接良好(图1上)。而OECs及单纯全切对照组各例脊髓断端连接较差,损伤区域内可见数个大小不等的液性囊腔(图1下)。

2.OECs的存活和迁移

OECs及单纯全切对照组断端间仅以少量组织相连,OECs对照组间隙内有黄褐色荧光物质,与脊髓断面接触不良,脊髓实质内未见任何荧光物质。FG对照组断端连接较好,间隙及实质内未见荧光物质。FG-OECs组断端间隙内有大量生长状态良好的OECs,核呈柔和均匀的蓝色,圆形或椭圆形,边界光滑清楚(图2A,2B),片状或条索状分布。大量OECs积聚于脊髓断面,临近的脊髓实质内亦可见部分OECs,主要分布于白质、灰质内,被膜内、被膜下及神经根内亦有分布,其中1例OECs集中沿白质迁移达4mm(图3)。间隙及实质内的OECs中夹杂有少量染色不均匀、边界不光滑、荧光较强的蓝色或黄褐色点状或小块状物质,系生存状态欠佳或已死亡的细胞,或为巨噬细胞和小胶质细胞。

3.免疫组织化学染色

FG-OECs组脊髓实质内未见明显空洞,可见较多的NF免疫反应纤维通过断端间隙(图4A,4B),纤维较长,与脊髓长轴方向排列一致,并与相邻切片相应部位OECs的分布一致。间隙内GAP-43免疫反应纤维与NF免疫反应纤维分布一致(图5A,5B)。FG组脊髓实质内未见明显空洞,有少量NF及GAP-43免疫反应纤维散在分布(图6A,6B,7A,7B),纤维较短,排列方向较零乱。OECs及单纯全切对照组脊髓实质内可见少量NF及GAP-43免疫反应纤维。

讨论

促进成年哺乳动物中枢神经再生有不同方法,OECs因其具有的独特作用而受到广泛







































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