摘要：目的研究岩黄连总碱对高糖高脂饮食诱导的代谢相关脂肪性肝病（MAFLD）小鼠的治疗作用。方法随机取C57BL/6小鼠7只设置为对照组，喂以正常饲料；造模小鼠给予高脂饮食和高糖饮水（含20%果糖水），连续喂养10周；将造模小鼠按体质量随机分为模型组、盐酸二甲双胍（阳性药，mg/kg）组和岩黄连总碱低、高剂量（25、mg/kg）组，继续饲以高脂高糖饮食，连续ig给药5周。记录小鼠体质量，取肝脏并拍照，测定小鼠肝脏质量，计算肝脏指数；应用血糖仪测定小鼠空腹血糖（FBG）及口服糖耐量（OGTT）；试剂盒法测定血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）及游离脂肪酸（NEFA）的水平；取肝组织进行HE染色、油红O染色和Masson染色；Westernblotting检测肝组织中AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）、p-AMPK、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、p-PI3K、蛋白激酶B（Akt）、p-Akt蛋白表达情况。结果与对照组比较，模型组小鼠体质量、肝脏指数显著升高；给药后小鼠体质量及肝脏指数显著下降（P＜0.05、0.01）。与模型组比较，岩黄连总碱显著降低小鼠的FBG及OGTT水平（P＜0.01）；显著降低血清TC、TG、LDL-C及NEFA水平（P＜0.01）；显著改善小鼠肝组织脂肪变及纤维化；显著上调MAFLD小鼠肝组织p-AMPK、p-PI3K、p-Akt蛋白水平（P＜0.01）。结论岩黄连总碱对MAFLD发挥显著治疗作用，其作用机制可能与通过激活AMPK/PI3K/Akt信号通路，减轻肝脏脂质沉积有关。

代谢相关脂肪性肝病（metabolicassociatedfattyliverdisease，MAFLD），曾用名非酒精性脂肪肝（nonalcoholicfattyliverdisease，NAFLD）［1-2］，是指除由酒精和其他对肝脏有明确损害致病因素引起的，以脂肪在肝细胞内过度沉积为主要病变特征的临床病理综合征［3］。其主要包括肝脏的脂质代谢异常引起的肝脂肪变，以及体内物质代谢紊乱，如血脂及血糖水平异常升高。MAFLD是一种慢性进展性疾病，患者早期无明显不适症状，多于体检或者其他相关疾病检查时发现，可出现乏力、胸胁隐痛等临床表现，随着病情进一步恶化，可进展为非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholicsteatohepatitis，NASH）及肝硬化（nonalcoholiccirrhosis，NAC），甚至肝癌［4-5］。近年来，MAFLD的发病率逐年升高，迄今为止已经取代病毒性肝炎成为全球最常见的慢性肝病［6］，占全球患病率的25.2%［7］，已成为严重的全球性公共健康问题。

脂肪肝为现代医学病名，中医学无明确的该病记载名。中医学根据MAFLD患者腹胀、乏力、胁痛、纳差的临床表现，将其命名为“痞满”“胁痛”“虚劳”等。《素问·五邪》云：“邪在肝，则两胁中痛”，《难经·五十六难》曰：“肝之积，名曰肥气，在左胁下，如覆杯，有头足”。由此可见MAFLD当属中医学“肥气”“积聚”等范畴［6］。岩黄连CorydalissaxicolaBunting，又名石生黄堇，为紫堇科紫堇属多年生草本植物，为云贵地区常用药，本品性凉、味苦，具有清热、消肿、利湿、止痛止血之功效，民间用于治疗火眼、痔疮出血及红痢、急性腹痛、肝炎、肝硬化、痢疾等症，现代医学研究表明，其具有抗病毒、抗炎、抗肿瘤、保肝利胆等作用［8-11］。蒙田秀等［12］研究表明，岩黄连提取物能显著改善四氯化碳（CCl4）诱导的小鼠肝损伤模型。同时，Wang等［13］进一步研究提示，岩黄连有效活性成分脱氢卡维丁对CCl4诱导的大鼠肝纤维化具有显著的改善作用，其作用可能与减少氧化应激、促进胶原溶解和调节纤维化相关基因有关。岩黄连总碱为岩黄连的有效部位，成分包括脱氢卡维丁（dehydrocavidine）、小檗碱（berberine）和巴马汀（palmatine）等，且脱氢卡维丁含量最高［14-15］。因此，本实验主要在已有研究的基础上，以高脂高糖饮食诱导的MAFLD小鼠模型考察岩黄连总碱对MAFLD的药效，并初步探讨其作用机制。

1　材料

1.1　动物

SPF级C57BL/6雄性小鼠35只，4～5周龄，体质量18～20g，购自山东斯科贝斯生物科技股份有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（鲁）。清洁级环境，温度湿度适宜，由中国药科大学药学动物实验中心饲养，适应性喂养1周后，进行MAFLD造模过程。

1.2　药品及主要试剂

岩黄连总碱，购自南京中山制药有限公司，产品批号，经HPLC检测，脱氢卡维丁、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱质量分数分别为13.79%、8.38%、1.52%；盐酸二甲双胍，购自中美上海施贵宝制药有限公司，产品批号ABE。

实验鼠生长繁殖饲料、60%脂肪供能高脂饲料（含60%乳脂、40%基础饲料，货号TP）、果糖，均购自南通特洛菲饲料科技有限公司；总胆固醇（totalcholesterol，TC）试剂盒（货号A-1-1）、三酰甘油（triglycerides，TG）试剂盒（货号A-1-1）、低密度脂蛋白胆固醇（lowdensitylipoproteincholesterol，LDL-C）试剂盒（货号A-1-1）、高密度脂蛋白胆固醇（highdensitylipoproteincholesterol，HDL-C）试剂盒（货号A-1-1）、游离脂肪酸（nonesterifiedfattyacids，NEFA）试剂盒（货号A-2-1），均购自南京建成生物科技有限公司；AMPK抗体（货号）、p-AMPK抗体（phospho-AMPKThr，货号）、Akt抗体（货号）、p-Akt抗体（phospho-AKTSer，货号）、PI3Kp85抗体（货号）、p-PI3Kp85抗体（phospho-PI3Kp85Tyr，货号），均购自美国CellSignalingTechnology公司；山羊抗兔二抗（货号ZJ-R）、山羊抗小鼠二抗（货号ZJ-M）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号PS），均购自上海碧云天生物技术有限公司；ECL化学发光超敏显色试剂盒（货号ES76），购自上海翊圣生物科技有限公司。

1.3　主要仪器

高速冷冻离心机（R型，Eppendorf，德国）；PB-N电子天平（MettlerToledo，德国）；MULTSKANSky全波长酶标仪（ThermoScientific，美国）；可调式移液器（上海赛默飞世尔仪器有限公司）；血糖仪及血糖试纸（江苏鱼跃医疗设备有限公司）；电泳仪（Bio-Rad，美国），转膜仪（Bio-Rad，美国），显影仪（上海天能科技有限公司）；密理博Direct-Q3实验室纯水/超纯水一体化系统（密理博，美国）。

2　方法

2.1　分组、造模及给药

小鼠适应性喂养1周后，随机取7只设置为对照组，余下的进行造模。对照组动物喂以正常饲料，造模组小鼠给予高脂饮食和高糖饮水（含20%果糖水）［16-18］。连续喂养10周，将造模小鼠按体质量随机分为模型组，岩黄连总碱低、高剂量（25、mg/kg）［19］组和盐酸二甲双胍组（mg/kg）［20-21］，每组7只小鼠，继续饲以高脂高糖饮食。对照组与模型组小鼠给予等量0.5%CMC-Na混悬液，岩黄连总碱与盐酸二甲双胍组ig给予相应的药物，连续给药5周。

2.2　体质量及小鼠肝脏指数的测定

给药期间每周对小鼠的体质量进行测定并记录。末次给药并取血完成后，小鼠脱颈椎处死，取肝脏，并拍照记录肝脏外观及形态，测定小鼠肝脏质量，计算小鼠肝脏指数。

肝脏指数＝肝脏质量（mg）/体质量（g）

2.3　空腹血糖水平（FBG）及口服葡萄糖耐量试验（OGTT）测定

末次给药后，小鼠禁食12h，自由饮水，次日早晨测定FBG；各组小鼠ig葡萄糖溶液（2g/kg），测定ig后15、30、60、min小鼠的血糖水平，并计算曲线下面积（AUC）［22-24］。

2.4　血清生化指标测定

血糖测定结束后小鼠摘眼球取血，收集于1.5mL离心管中，室温静置2h，r/min离心15min，取上清置于-80℃保存备用，按试剂盒说明书分别测定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C及NEFA的浓度。

2.5　肝组织HE染色及油红O染色

HE染色：取小鼠肝脏置于4%多聚甲醛中固定，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋切片（切片厚度4μm）后行HE染色，中性树胶封片［25-26］。

油红O染色：小鼠肝脏固定后置于25%～30%的蔗糖溶液脱水48h，OCT包埋剂包埋并于冰冻切片机切取15μm的冰冻切片；蒸馏水浸洗，60%异丙醇浸洗后进行油红O染色，水溶性封片剂封固，并置于4℃条件下保存［27-29］。

2.6　肝组织Masson染色

肝脏固定后常规包埋脱蜡；用蒸馏水湿润玻片60s；核染液染色50s，弃染液，冲洗液冲洗30s；浆染液染色20s，弃染液，冲洗液冲洗30s；黄色分色液分色8min，弃染液；直接用蓝色复染液染色4min，弃染液，用无水乙醇冲洗干净；吹干后，封片［30］。

2.7Westernblotting检测

称取适量肝组织，剪碎并按质量（g）与体积（mL）比1∶9的比例加入RIPA裂解液，匀浆仪匀浆裂解，r/min离心10min取上清，BCA法测定蛋白浓度并适当稀释。将蛋白与5×loadingbuffer以4∶1的比例混匀，℃煮沸变性，进行10%SDS-PAGE垂直电泳，垂直电泳结束后冰浴环境水平电泳转至PVDF膜上，5%BSA室温封闭膜2h，一抗孵育过夜（4℃），次日TBST漂洗，二抗孵育，ECL显影，ImageJ软件分析目的蛋白条带灰度值［31］。

2.8　统计学处理

采用SPSS19.0统计软件对所得数据进行统计分析，计量资料以x?±s表示，组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），组间比较分析采用LSD法（方差齐）和Games-Howell法（方差不齐）。

3　结果

3.1　岩黄连总碱对MAFLD模型小鼠的体质量、肝脏形态及肝脏指数的影响

如图1A所示，造模结束后，模型组小鼠的体质量与对照组比较显著升高（P＜0.01）；自给药第14天起，岩黄连总碱低、高剂量组小鼠的体质量与模型组比较显著下降（P＜0.05、0.01），并维持至实验结束。小鼠肝脏指数及肝脏形态如图1B和C所示，与对照组比较，模型组小鼠肝脏指数显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，岩黄连总碱低、高剂量小鼠肝脏指数显著下降（P＜0.05、0.01），且呈剂量相关性，盐酸二甲双胍也能显著降低MAFLD小鼠肝脏指数（P＜0.01）。同时与对照组比较，模型组小鼠的肝脏出现明显的肥大，且触之质脆，油腻；与模型组比较，岩黄连总碱低、高剂量组均显著改善肝脏肥大症状，表现为肝脏体积变小，颜色深红，且不易破碎。结果表明，高脂高糖饮食会使小鼠的体质量出现显著升高，肝脏出现明显肥大症状，岩黄连总碱能够明显降低MAFLD小鼠的体质量且改善其肝脏脂肪变。

3.2　岩黄连总碱对MAFLD模型小鼠的FBG及OGTT的影响

如图2所示，模型组小鼠的FBG与对照组比较显著升高（P＜0.01），岩黄连总碱低、高剂量组及盐酸二甲双胍组小鼠的FBG与模型组比较显著下降（P＜0.01）。OGTT结果显示，ig葡萄糖后15min，模型组小鼠血糖值与对照组比较显著升高（P＜0.01），岩黄连总碱低、高剂量组及盐酸二甲双胍组小鼠的血糖值与模型组比较显著下降（P＜0.01）。ig葡萄糖后30、60、min各组的血糖水平均表现为下降趋势，然而模型组小鼠各时间点的血糖仍显著高于对照组小鼠（P＜0.01），岩黄连总碱低、高剂量组及盐酸二甲双胍组小鼠的血糖与模型组比较显著下降（P＜0.01）。模型组小鼠的AUC与对照组比较显著升高（P＜0.01），岩黄连总碱低、高剂量组及盐酸二甲双胍组小鼠的AUC与模型组比较显著下降（P＜0.01）。结果表明，高脂高糖饮食会使小鼠的FBG升高，岩黄连总碱可以显著降低MAFLD小鼠的血糖水平，同时长期高脂高糖饮食会导致小鼠糖耐量受损，机体对血糖调节能力下降，岩黄连总碱能显著缓解上述症状。

如图3所示，模型组小鼠血清中的TC、TG、LDL-C、NEFA浓度与对照组比较显著升高（P＜0.01），岩黄连总碱低、高剂量组及盐酸二甲双胍组小鼠血清中的TC、TG、LDL-C、NEFA浓度与模型组比较均显著降低（P＜0.01）。模型组小鼠血清中的HDL-C浓度与对照组比较显著降低（P＜0.01），岩黄连总碱低、高剂量组及盐酸二甲双胍组小鼠血清中的HDL-C浓度与模型组比较虽然出现上升的趋势，但并无明显差异。结果表明，岩黄连总碱能够显著调节MAFLD小鼠的血脂水平，改善小鼠的脂质代谢紊乱。

3.4　岩黄连总碱对MAFLD模型小鼠的肝组织病理变化的影响

如图4所示，对照组小鼠肝脏HE染色显示肝脏结构完整，中央静脉轮廓清晰（图中绿色*号），且肝索沿着中央静脉呈放射状排列，肝小叶及小叶间未见明显炎症细胞浸润；与对照组比较，模型组小鼠肝小叶结构被破坏，伴肝细胞膨胀，中央静脉周围肝细胞脂质堆积严重，胞质挤满空泡（图中黑色箭头所示），肝小叶炎细胞浸润明显且肝细胞呈现不均一的核固缩，核碎裂以及核溶解的现象［32-33］。与模型组比较，岩黄连总碱和盐酸二甲双胍显著改善肝细胞脂质堆积以及肝细胞凋亡现象。

油红O染色进一步提示，模型组小鼠肝细胞有严重的脂肪堆积（图中蓝色箭头所示）。与模型组比较，岩黄连总碱低、高剂量组及盐酸二甲双胍组小鼠肝细胞脂质堆积的情况有明显改善。以上结果初步说明岩黄连总碱能显著改善MAFLD小鼠肝脂肪变症状。

3.5　岩黄连总碱对MAFLD模型小鼠的肝纤维化的影响

研究表明，慢性或反复性肝损伤最终都会导致肝纤维化的生成，以细胞质外基质（ECM）蛋白主要是胶原蛋白的过度积累为特征［34-36］。肝纤维化是MAFLD严重程度的重要预测指标［37］。因此，本研究对小鼠肝脏进行Masson染色来进一步考察岩黄连总碱对于MAFLD引起的肝纤维化改善作用。如图5所示，对照组肝组织血管壁周围可见少量胶原纤维，呈深蓝色，属正常范围。模型组肝组织内大量胶原纤维沉积，呈蓝色团块状，自汇管区周围向外延伸，纤维条索较粗且染色着色较深，表明胶原纤维较多，肝组织纤维化明显［38-39］。与模型组比较，岩黄连总碱和盐酸二甲双胍对肝组织纤维化有明显改善作用。

3.6　岩黄连总碱对MAFLD模型小鼠肝组织AMPK/PI3K/Akt信号通路的影响

为了明确岩黄连总碱对MAFLD治疗作用的机制，利用Westernblotting技术检测小鼠肝组织中能量代谢调节的关键分子AMPK以及胰岛素信号通路相关的PI3K、Akt蛋白表达情况。如图6所示，与对照组比较，模型组小鼠肝组织p-AMPK、p-PI3K、p-Akt蛋白表达量显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，岩黄连总碱高剂量组及盐酸二甲双胍组小鼠肝组织p-AMPK、p-PI3K、p-Akt蛋白表达量显著升高（P＜0.05、0.01）。

4　讨论

MAFLD作为一种全身代谢性疾病，发病率逐年升高，更有年轻化的趋势［40］。寻找和开发治疗MAFLD的相关药物变得尤为迫切。目前治疗MAFLD的化学药发展迅速，但缺少疗效较好的药物［4，41］。中医药治疗MAFLD主要包括改善胰岛素抵抗、调节脂质代谢和运转、改善肠道菌群失调、减轻氧化应激水平与调节免疫等，具有多成分、多靶点、多通路的作用特点［42］。但是，中药治疗代谢性疾病是如何启动以及通过哪些具体信号转导通路发挥作用等问题有待进一步探究［43］。

岩黄连在《中华本草》《贵州草药》等医学书籍中有记载，为云贵地区常用药，具有抗病毒、抗炎、抗肿瘤、保肝利胆等作用［9-11］。研究显示岩黄连及其有效部位能显著缓解CCl4诱导的大鼠急性肝炎症状［12-13］。因此本研究主要以高脂高糖诱导的MAFLD小鼠模型探究岩黄连总碱对MAFLD药效及并初步阐述其相关分子机制。

实验结果表明，岩黄连总碱对高脂高糖饮食诱导的MAFLD小鼠具有治疗作用。小鼠体质量、肝脏形态及肝脏指数的变化表明，岩黄连总碱对MAFLD小鼠体质量增加以及肝脏的脂肪变具有明显的改善作用；另外，实验结果进一步显示，岩黄连总碱能够显著降低MAFLD小鼠FBG水平，改善OGTT损伤，说明岩黄连总碱能够显著改善MAFLD小鼠胰岛β细胞功能受损，恢复机体对血糖的调节能力［44-45］；小鼠血清生化指标结果表明，高脂高糖饮食会引起小鼠的脂质代谢紊乱，岩黄连总碱对小鼠脂代谢紊乱有明显改善作用进而减少脂质堆积；小鼠肝组织的HE染色及油红O染色结果表明，岩黄连总碱对MAFLD小鼠的肝脏脂肪变性和堆积有明显的改善作用；小鼠肝组织Masson染色结果表明，小鼠的MAFLD进一步恶化发展为肝纤维化，而岩黄连总碱呈现出对肝纤维化有明显的改善作用。

在肝脏中，肝胰岛素信号转导途径的完整性对于维持肝细胞正常生理功能起着至关重要的作用［46］。肝胰岛素抵抗（insulinresistance，IR）是MAFLD重要诱发因素，任何胰岛素信号转导途径成分的蛋白质表达不足都可能导致肝IR［47］。AMPK是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，作为细胞能量代谢过程中重要的传感器和调节剂，AMPK是研究代谢相关疾病的核心，AMPK磷酸激活后会增加细胞的AMP/ATP比，从而调节细胞能量代谢过程［45，48］。PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，与多种细胞功能有关，包括细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运，同时也是胰岛素信号通路中关键信号分子［46］。作为PI3K的关键下游效应子，Akt主要负责PI3K引发的生物信息的传输，包括细胞代谢、细胞周期调控、细胞生长以及通过各种靶蛋白和下游途径的磷酸化而引起的细胞凋亡。AMPK和PI3K/Akt途径并非彼此隔离，而是相互作用复杂。激活AMPK后，可以通过AMPK与PI3K/Akt信号通路之间的相互作用缓解由于胰岛素抵抗引起的MAFLD［22］。在高脂高糖诱导的MAFLD模型中，p-AMPK/AMPK、p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白的表达水平比均显著降低，在高脂高糖的饮食下肝细胞代谢产生大量ATP，而AMP含量减少，导致AMPK的磷酸化程度降低，从而进一步导致PI3K/Akt信号通路受阻［22，49-51］。岩黄连总碱可以一定程度逆转高能饮食导致的AMPK/PI3K/Akt信号的下调。此外，岩黄连总碱可改善肝脂肪变性，增加p-AMPK的表达水平并导致PI3K/Akt活化。通过影响胰岛素信号蛋白的表达和激活从而减轻肝脂肪变性。

本研究一方面证实岩黄连总碱对MAFLD具有显著治疗作用，并进一步说明其作用机制可能是与AMPK/PI3K/Akt信号通路的活化有关，后期本课题组将对岩黄连总碱对NASH的改善作用作进一步探索。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来源：陈萍，鞠霖杰，成俊，刁和芳，赵开军，邱志霞，黄芳．岩黄连总碱对代谢相关脂肪性肝病小鼠的治疗作用及分子机制研究[J].药物评价研究,,44(3):-.