文章来源

中华肝脏病杂志,,29(01):21-24

作者：汤珊白丽郑素军

DOI:10./cma.j.cn--

摘要

Wilson病（WD）是一种ATP7B基因突变导致铜排泄障碍的常染色体隐性遗传性单基因疾病。药物治疗是目前WD的主要治疗方法，药物应答不佳或急性肝衰竭需考虑肝移植，但面临药物治疗依从性以及不良反应、肝源的紧缺等问题。WD的基因治疗有可能永久纠正异常铜代谢，是目前研究的焦点问题。现围绕基因治疗的载体和CRISPR/Cas9基因编辑系统总结WD基因治疗的研究进展。

肝豆状核变性（hepatolenticulardegeneration，HLD）又称Wilson病（Wilsonsdisease，WD），是一种相对罕见的常染色体隐性遗传病[1]。估计全球患病率约为1∶[2]。该疾病是由于编码铜跨膜转运蛋白的ATP7B基因发生突变，导致铜蓝蛋白合成及铜排泄过程发生障碍，使过量的铜沉积于肝脏、大脑、肾脏、角膜等组织器官中，从而引起肝功能异常、肝硬化、神经精神症状为主等不同的临床表现[3]。现已鉴定出多种引起疾病的ATP7B基因突变，其中HisGln（HQ）是欧洲和北美最常见的突变，而ArgL是亚洲的最常见突变[4]。鉴于WD明确是ATP7B基因突变所致的疾病，基因治疗有广阔前景。本文就WD基因治疗的研究进展进行综述。

一、WD的传统治疗方法

WD属于少数可通过药物成功治疗的遗传代谢疾病。如果早期诊断，正确应用药物可使铜达到负平衡[5]。目前用于治疗WD的药物主要分为2类。一类为金属螯合剂，如D-青霉胺（d-penicillamine，DP）和曲恩汀。该类药物通过与铜结合充当螯合剂，诱导铜经尿液排出，促进铜排泄。另一类药物为锌盐，可诱导肠道肠上皮细胞中金属硫蛋白的合成，从而抑制铜经肠道吸收[6]。在急性肝功能衰竭或代偿性肝硬化患者中，如果药物治疗无效，可以对WD患者进行肝移植治疗[7]。肝移植可以被视为基因缺陷的表型校正。将正常的肝脏移植到WD患者中，基本上可以恢复WD患者正常的铜代谢以及正常的肝功能。

目前WD的药物治疗存在一些局限性。第一，纠正WD患者异常的铜代谢并清除体内蓄积的铜，是一个需要长期维持的过程，因此，除肝移植患者外均应给予终生治疗[8]。有研究表明在平均11.7年的随访时间中，只有74.1%的患者能坚持治疗[9]。第二，治疗期间可能出现神经系统症状恶化。治疗期间，约有50%的WD患者仍存在神经系统症状，10%的患者出现不可逆神经系统症状恶化[10]。第三，约三分之一的WD患者用药期间会出现与药物相关的不良事件或严重不良事件，导致治疗失败[11]。肝移植治疗亦有局限性。一是肝移植后需要终生免疫抑制，通常仅用于急性肝衰竭或失代偿期肝硬化患者。二是肝移植患者可能会出现神经系统症状加重[12]。综上所述，有必要寻找安全性更好，对神经功能障碍有更好疗效的新疗法，以及能够永久纠正并及早纠正异常铜代谢治疗方式。

二、基因治疗的概述

基因治疗,是指对致病基因进行纠正或置换突变致病基因的一种治疗方法。主要是利用合适的载体将一个正常功能的基因插入缺陷宿主细胞中，用于治疗与单个基因缺陷相关的遗传性疾病[13]。理论上，WD是ATP7B基因突变所致的疾病，野生型ATP7B基因在肝细胞中的表达应该可以改善所有与疾病相关的肝脏和神经系统症状。WD的基因治疗旨在向肝细胞提供足够数量的有功能ATP7B蛋白，在肝脏及神经系统症状发作之前的疾病早期阶段恢复铜代谢[14]。目前的基因治疗尚处于动物研究阶段，未真正应用于临床。

三、WD基因治疗的病毒载体

基因治疗最重要的部分就是正确选择载体。理想的载体需要具备以下特质：（1）载体实现的转基因表达必须持续尽可能长的时间；（2）基因表达的载体需要较低的免疫原性；（3）可以高滴度、高纯度生产；（4）有细胞特异性，仅肝细胞被转导；（5）具有足够的克隆能力；（6）没有毒性[15]。目前广泛应用的具有复制缺陷的重组病毒载体包括腺病毒，慢病毒（lentiviralvectors，LV）和腺相关病毒（adeno-associatedvirus，AAV）。

（一）腺病毒载体

腺病毒载体是一种大的、无包膜的双链DNA病毒，由于其能够在体内高效地转导不同类型的细胞，并且能够高滴度扩增，因此最早用于WD的基因治疗[16]。早期研究表明，应用腺病毒载体转导ATP7B基因对LEC大鼠（longevancin-namon）进行治疗后，可以检测到铜跨膜转运蛋白在肝脏中表达，使铜蓝蛋白的代谢及铜经胆汁排泄恢复正常[17]。与其他载体相比，腺病毒载体的优势是能够携带高达30kb的插入片段，并且能最大程度地减少病毒基因组DNA与宿主基因组的整合，降低插入诱变的风险[18]。但由于腺病毒载体会触发宿主针对病毒转导细胞的免疫反应[19]，导致转基因只能瞬时表达，治疗效果仅能持续几天，因此腺病毒载体不适用于需要转基因长期表达的Wilson病。

（二）慢病毒载体

慢病毒载体是以人类免疫缺陷病毒-1来源的一种病毒载体，能有效地将其基因组整合到宿主细胞的基因组中，从而使转基因稳定表达[20]。携带有外源基因的慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，将其进行收集和浓缩后可直接感染宿主细胞或者动物模型，实现外源基因在细胞或活体组织中表达[21]。

慢病毒载体不仅可以转染分裂细胞，也可以转染未分裂细胞，同时其具有穿透完整核膜的能力以及携带高达10kb的插入片段的能力，因此被应用于WD的基因治疗。Merle等[22]用慢病毒载体转染LEC大鼠的原代肝细胞，在治疗后的不同时间点均在肝脏中检测到ATP7B基因的表达，并可持续至实验结束，长达24周。但是对肝脏组织切片进行定量免疫荧光分析显示，与治疗后2周相比，治疗后24周ATP7B阳性肝细胞的百分比较低。基因治疗的效果不好可能是由于细胞移植不充分，细胞植入和增殖不足。为了改进疗效，Chen等[23]将携带ATP7B基因的慢病毒载体移植到骨髓间充质干细胞，再将骨髓间充质干细胞经门静脉注射到LEC大鼠体内，结果显示在移植后第4、12和24周均检测到较高水平的ATP7B表达和血清铜蓝蛋白含量。这种在体外对细胞进行基因修饰的方法避免了病毒颗粒在全身扩散，因此可能比将携带ATP7B基因的慢病毒载体直接转导到宿主肝脏更安全。

尽管慢病毒载体具有许多适合基因治疗的优势，但它们将基因组整合到宿主细胞染色质中的特性使其具有诱变风险。除此之外慢病毒载体可以远距离（超过10kb）上调细胞基因，人类基因组中有多个原癌基因，因此，慢病毒载体可能会诱发癌基因失调。应用慢病毒载体进行基因治疗的安全性值得进一步评估。

（三）AAV载体

AAV载体是一种无包膜的单链DNA病毒，属于细小病毒科。其优势有以下几点：（1）可以介导转基因的长期表达；（2）既可以转染分裂细胞，也可以转染未分裂细胞；（3）不同血清型有特定组织嗜性，其中AAV8对肝脏有特异性；（4）转基因表达水平高；（5）AAV病毒基因组可以作为附加体（基因组外环状DNA）存在于宿主体内，降低了插入诱变的可能性[24]。这些优势使AAV8载体适合用于WD的基因治疗。Murillo等[25]在研究中用编码人ATP7BcDNA的AAV8载体转导了ATP7B-/-的WD小鼠模型的肝脏，在给药后，发现治疗后血清转氨酶降低。但是由于ATP7B基因组的大小超过了AAV载体的最佳包装容量，这导致病毒载体不能高滴度生产，研究中小鼠血液循环中的铜蓝蛋白水平并没有完全恢复，肝脏中的铜含量仍然较高。为了改进方案，Murillo等[26]在原研究的基础上构建了一个优化的较短的腺病毒载体。保持蛋白质运输所必需的氨基末端信号肽不变，将不影响铜转运功能的ATP7B的金属结构域1～4去除，这使编码区的大小减少了1.29kb。这个版本的ATP7BcDNA更有利于AAV载体的高滴度生产，达到了更好的治疗效果。

AAV载体目前的最主要缺陷为载体的最佳包装容量为小于5kb，而ATP7BcDNA的大小为5.2kb，这导致病毒载体不能高滴度生产。如果能进一步构建出合适的优化ATP7BcDNA，那么应用AAV载体的基因治疗将有更大的进展。除此之外，在血友病临床试验中显示，使用重组AAV治疗WD可能面临的主要限制是对载体产生急性反应，这将加剧肝损伤，或者产生免疫反应，导致转导的肝细胞被消除[27]。对患者进行密切随访，或通过给予短疗程的类固醇将这些反应降至最低。

四、CRISPR/Cas9基因编辑系统在WD中的应用

CRISPR/Cas9系统是最早发现于细菌和古细菌中的一种具有防止病毒DNA或者其他外源DNA入侵的免疫机制。通过对crRNA和tracrRNA进行改造并连接在一起，得到小向导RNA（smallguideRNA，sgRNA），在sgRNA的指引下，Cas9蛋白与DNA靶序列邻近原始间隔区相邻基序的特定位点相互作用并引起DNA双链断裂（double-strandbreak，DSB）。DSB的产生可诱导两种DNA修复途径：同源重组修复和非同源末端连接重组修复[28]。利用这两种修复途径可实现基因组编辑的目的并应用于基因治疗中。基因组编辑工具CRISPR/Cas9为单基因遗传疾病和感染性疾病提供了一种新的基因治疗潜力工具。在过去的几年里，许多研究将其应用在单基因遗传疾病或感染性疾病的动物模型及体外细胞中，结果均表明CRISPR/Cas9可以靶向纠正导致疾病的异常遗传基因[29,30,31]。

传统的基因治疗方法是使用病毒载体将正常功能的基因转移缺陷宿主细胞中。病毒DNA可能会整合到细胞DNA中，从而干扰有价值的基因，如肿瘤抑制基因[32]。基因组编辑技术可以用于修饰基因或使特定基因失活，如锌指核酸酶和转录激活物样效应核酸酶[33,34]。年开始，CRISPR/CAS9系统已成为一个强大的基因编辑工具，取代了之前开发的技术[35,36,37]。年，Liu等[38]首次通过CRISPR/Cas9替换了小鼠模型中ATP7B基因的第8外显子。近期，Pohler等[39]使用CRISPR/Cas9基因编辑在HEKT细胞中产生ATP7B点突变，以模拟WD相关基因型，然后通过使用单链寡核苷酸来纠正这一突变，模拟了体外WD点突变的基因校正。结果表明，CRISPR/Cas9介导的ATP7B点突变校正是可行的，并有可能应用到临床上。

但是CRISPR/Cas9在基因治疗临床应用中仍需面对由于脱靶效应而造成的基因突变的风险。除此之外，还有Cas9蛋白可能引起免疫反应以及Cas9蛋白过大不易包装入AAV等问题。

五、WD基因治疗的前景及展望

尽管在动物模型中进行的基因治疗研究前景看好，要将基因疗法用于人类WD的治疗，还有很长的路要走。将动物研究转化到临床试验需要严格的安全性和有效性证明。因此，对于WD基因治疗的首要任务是降低插入突变的风险，应进一步开展针对基因组整合的基因治疗方法致癌风险的研究。除此之外，虽然CRISPR基因编辑的发展为基因治疗提供了很好的前景，但是这种方法的临床前研究很少，将其应用到临床需要更长的时间。

值得

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