高超　郭小瑜　翁菱琳　周王琛　沈阳　於阳　韩园

，徐州医科大学临床医学系（高超、翁菱琳、周王琛）；，徐州医科大学麻醉学院（郭小瑜、沈阳、於阳）；，医院麻醉科（韩园）

国际麻醉学与复苏杂志,,38(12):-.

DOI：10./cma.j.issn.-..12.

基金项目：江苏省大学生创新创业训练

计划（Y）

ORIGINALARTICLES

神经病理性疼痛（neuropathicpain,NP）是指“由躯体感觉神经系统的损伤或疾病所直接引起的疼痛”，是一种复杂和难以治愈的疾病，致残率高。研究发现，小胶质细胞的活化对于中枢神经元的敏化起到重要的推动作用，在NP形成的早期，小胶质细胞相关细胞内信号的激活作用突出。其中丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase,MAPK）家族的p38MAPK在介导神经病理性痛的发生、发展过程中扮演重要角色。p38蛋白激酶活化可促使下游NF-κB等炎症因子水平的升高，进而参与活化痛觉神经元以及激活星形胶质细胞。因此，研究和发现安全地抑制小胶质细胞活化，尤其是抑制p38MAPK活化的药物是治疗NP的重要方向。小胶质细胞活性抑制剂米诺环素虽然在基础实验中疗效显著，但因副作用大，其临床应用受到很大限制。因此，寻找安全、有效抑制小胶质细胞活化，尤其是p38MAPK活化的治疗药物，是治疗NP可能方法之一。

人参皂苷Rg1（ginsenosideRg1,Rg1）是人参皂苷单体之一，中医药中镇痛药三七的主要有效成分，具有广泛的药理活性。Rg1可通过抑制p38MAPK相关信号通路发挥保护性作用。研究发现，在神经系统，Rg1可能通过影响p38MAPK信号通路抑制胶质细胞损伤而促进脑缺血中神经元的修复；在心血管系统，Rg1可以通过调控p38MAPK通路产生促进血管生成和抗心肌纤维化等作用，降低心肌梗死和动脉瘤的发生率；在帕金森病大鼠，人参皂苷Rg1可影响p38MAPK信号通路及环氧化酶-2的表达而对小鼠多巴胺神经元起到一定保护作用。

本研究观察Rg1对NP大鼠的热痛阈的影响，并进一步探讨Rg1对小胶质细胞活化及其p38MAPK/NF-κB表达变化的作用。

1　材料与方法

1.1　实验试剂及仪器

人参皂苷Rg1，米诺环素，OX-42抗体，p38抗体，二抗，NF-κB亚单位p65抗体，足底热痛测试仪，2%盐酸利多卡因注射液，10%水合氯醛。

1.2　方　法

1.2.1　实验动物及模型制作

健康成年雄性SD大鼠，体重~g。

将大鼠麻醉后俯卧位于操作台上，腰部用木架垫高。大鼠腰部髂前上棘体表定位，水平连线为大鼠L6位置，记号笔记号，用剪刀将背部备皮、碘伏棉签消毒、铺无菌洞巾。在大鼠背部L3~L4间隙处行1.5cm的切口，小心分离肌肉等组织，将L3~L4间隙手术视野暴露。25号针轻轻挑破黄韧带及硬脊膜。从黄韧带破口小心置入PE-10导管，置入方向为大鼠头侧端，置入长度1.5~2.0cm，当清亮液体流入PE管里，且PE管置入时大鼠有甩尾行为，表明PE管已在大鼠蛛网膜下腔。用手术缝合线将近侧PE管固定在大鼠的韧带上，然后缝合手术切口。用手术硬膜外穿刺针从大鼠皮下穿出大鼠颈背处，外端留2.0~2.5cmPE管。用酒精灯将PE管外口快速点烧封堵，防止大鼠脑脊液外漏。消毒，缝皮。术后单笼喂养。如大鼠有肢瘫或导管脱出者予以剔除。

次日向PE管推入2%盐酸利多卡因注射液10μl，以0.5min内大鼠下肢瘫痪，并且在0.5h大鼠下肢恢复行动表明置管手术成功。当大鼠行为异常或者下肢表现跛行、瘫痪等，手术部位发生感染，导管脱落时将大鼠剔除。

慢性坐骨神经压迫损伤（chronicconstrictiveinjury,CCI）NP模型制作：10%水合氯醛（mg/kg）腹腔内注射，在大鼠左侧大腿中后部切开1.5~2.0cm的纵向切口，钝性分离股二头肌，用40-铬制肠线在其三叉部近端环绕神经干分别做4个轻度结扎环，间距1mm，结扎强度以引起大鼠小腿肌肉轻度震颤为宜，止血，缝合后送回动物室饲养。假手术+鞘内生理盐水组除不结扎坐骨神经外，其余手术步骤同上。以Hargreaves法测定热刺激缩足反射潜伏期（thermalwithdrawallatency,TWL），术后第7天CCI+鞘内生理盐水组手术侧TWL下降40%以上者视为CCI模型成功。

1.2.2　实验分组

取置管成功的大鼠36只，按随机数字表法分为6组（每组6只）：①假手术+鞘内生理盐水组（A组），仅切开及缝合大鼠CCI手术造模相应区域皮肤，分别于假手术前1d和假手术后第1、2、3天连续4d鞘内注射10μl生理盐水；②CCI+鞘内生理盐水组（B组），分别于手术前1d和手术后第1、2、3天连续4d鞘内注射10μl生理盐水；③CCI+鞘内低剂量Rg1组（C组），分别于手术前1d和手术后第1、2、3天连续4d鞘内注射20μgRg1（10μl）；④CCI+鞘内中剂量Rg1组（D组），同上分别鞘内注射50μgRg1（10μl）；⑤CCI+鞘内高剂量Rg1组（E组），同上分别鞘内注射μgRg1（10μl）；⑥CCI+鞘内米诺环素组（F组），同上分别鞘内注射50μg米诺环素（10μl）。给药时间安排在下午2~4点，各组分别于术后第14天完成TWL测定后处死动物取脊髓腰膨大，-80℃低温冰箱保存。

1.2.3　TWL测定

手术前1d和手术后第1、3、5、7、10、14天分别测量各组术侧TWL，每次测量安排在上午8~10点，室温恒定在24℃左右，外界环境安静。将大鼠置于测痛仪玻璃板上，使用热辐射照射术侧爪掌面中部，记录从照射到缩腿反应时间。每只大鼠测量5次，间隔15min，取其平均值。

1.2.4　Westernblot法检测离子钙接头蛋白抗原（ionizedcalciumbindingadaptormolecule-1,IBA-1）、p38MAPK/NF-κB亚单位p65表达水平

提取新鲜L4~L6脊髓组织，称重后切小块放入管中。加入细胞裂解液（含苯甲基磺酰氟、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂）10ml/g，用匀浆器每次30s低速匀浆10min，间隔3min，反复多次匀浆，至组织完全裂解（所有操作均在冰浴中完成，0℃左右），裂解液于预冷的离心机中10r/min（离心半径3cm），离心15min，上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。Westernblot实验步骤：根据测定的蛋白样品的实际浓度，按每个加样孔μg的上样量计算出各组样品的试剂上样体积，与0.05mol/L的SDS上样缓冲液混匀，98℃煮沸10min，冷却至室温配制聚丙烯酰胺凝胶（SDS凝胶：6%的浓缩胶，8%~12%的分离胶）将蛋白样品移入凝胶泳道，浓缩胶设置电压70V20min，分离胶设置电压V90min，蛋白通过湿转转至硝酸纤维素膜上，设置电流mA恒流湿转，根据分子大小选择适当的转膜时间，5%的脱脂奶粉封闭1h加入OX-42抗体（1∶），4℃过夜用0.01mol/L浓度的PBS（pH7.5）冲洗3遍，每次10min，加入二抗（1∶），孵育1h，用PBS冲洗3遍，每次10min，配制ECL显影液，暗室中显影、定影。

1.2.5　免疫组织化学检测脊髓水平OX-42表达水平

将组织从-80℃低温冰箱取出，室温下复温。用4%多聚甲醛溶液将大鼠脊髓固定8h，然后将脊髓放入4℃20%蔗糖溶液中脱水6h。第2天取出标本，在-20℃左右冰冻切片机冠状切片，厚约30μm。将切片放入0.01mol/L浓度的PBS缓冲液中清洗3遍，每次约5min，清洗完将切片放入6孔板中，并滴加Tritoon×溶液4滴，常温下放在摇床上轻轻摇晃约5~6min后，将切片取出，滴加浓度3%双氧水静置15min，防止过氧化物酶对实验的影响。将切片放入0.01mol/L浓度的PBS缓冲液中清洗3遍，每次约为5min，往切片中加入小鼠抗大鼠OX-42抗体（1∶），在4℃冰箱静置2d。将切片放入0.01mol/L浓度的PBS缓冲液中清洗3遍，每次约5min，滴加PolymerHelper，常温下放在摇床上轻轻摇晃40~60min。将切片放入0.01mol/L浓度的PBS缓冲液中清洗3遍，每次约5min，滴加辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG，常温下放在摇床上轻轻摇晃40~60min。将切片放入0.01mol/L浓度的PBS缓冲液中清洗3遍，每次约5min，滴加DAB溶液中（DAB1滴，缓冲液1ml）μl，摇匀，显色3~5min。显微镜下操作，用0.01mol/L浓度的PBS缓冲液中断显色反应，最后将切片放于防脱载玻片上，自然干燥。

2　结　果

2.1　与A组比较，B组的TWL值在术后各日均明显减少（P0.01）；与B组比较，C组TWL值在术后第1、3、10天明显增高（P0.05）；与B组比较，D组、E组、F组TWL值在术后各日明显增高（P0.05，表1、图1）。

2.2　与A组比较，B组的IBA-1明显增高（P0.05）；与B组比较，D组、E组、F组的IBA-1均明显降低（P0.05，图2）。

2.3术后第14天，取A组、B组、E组和F组大鼠脊髓背角，通过免疫组织化学染色检测大鼠脊髓背角组织中OX-42阳性小胶质细胞数。与B组比较，E组、F组大鼠脊髓背角组织中阳性小胶质细胞数量均明显减少（P0.05，图3）。

2.4　与A组比较，B组p38MAPK明显增高（P0.05）；与B组比较，D组、E组、F组p38MAPK均明显降低（P0.05，图4）。

与A组比较，B组NF-κB亚单位p65明显增高（P0.05）；与B组比较，E组、F组NF-κB亚单位p65比值均明显降低（P0.05，图5）。

3　讨　论

很多研究表明胶质细胞的异常激活在NP中发挥着重要作用，而小胶质细胞活化在NP的早期扮演了重要角色。在神经损伤的早期，大量细胞因子、炎性介质和神经活性物质产生并释放（如一氧化氮、ATP、花生四烯酸、TNF、神经生长因子、IL等），招募并活化了大量小胶质细胞，进而增强脊髓背角神经元的兴奋性，使NP进一步发展和持续，最终导致神经系统功能障碍。小胶质细胞抑制剂

通过抑制小胶质细胞激活，可有效阻断这一系列病程的发生与发展。作为小胶质细胞的特异性抑制剂，米诺环素能有效抑制炎性介质的释放，降低神经元兴奋性以及抑制疼痛相关胞内信号转导通路。米诺环素虽然在基础实验中疗效显著，但是长期应用米诺环素将导致严重的副作用，包括过敏反应、肝损害等，其临床应用受到了很大限制。因此，寻找到安全、有效、相对安全的小胶质细胞抑制剂非常重要。

研究发现中医药中镇痛药三七的有效成分之一的Rg1，可能通过抑制p38MAPK相关信号通路发挥保护性作用。本研究探讨了Rg1对CCI导致的热痛觉超敏的影响，首次发现，Rg1可以显著抑制CCI导致的大鼠术侧热痛觉超敏，具有剂量依赖性，并有效地抑制了脊髓小胶质细胞的活化水平及其p38MAPK/NF-κB通路的表达，推测其镇痛机制可能通过抑制小胶质细胞p38MAPK/NF-κB通路上下游分子表达水平，进而抑制小胶质细胞的过度活化来实现的。

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